实例解读| lncRNA在胃癌中的作用

长链非编码RNA (lncRNA) 作为当前研究的热点，已经被证明在致癌机制有重要的作用。但是，在胃癌研究中，关于lncRNA的研究还是空白。我们之前已经为大家讲解了很多关于lncRNA的最新研究进展和分析方法，今天小编为大家带来的这篇文章：作者巧妙地把生物信息学分析和分子学实验结合在了一起，犹如一场好莱坞大片，看的酣畅淋漓，大家可以学到了很多lncRNA的分析方法以及实验的思路；作者用了不同的方式和角度去帮助自己对结果的验证，但是文章整体却并没有堆砌感。 

简单介绍：

论文题目：LncRNA GClnc1 Promotes Gastric Carcinogenesis and May Act as a Modular Scaffold of WDR5 and KAT2A Complexes to Specify the Histone Modification Pattern

发表杂志：CANCER DISCOV; 6(7): 784-801.

发表年份：2016年

影响因子：20.011

发表单位：上海交通大学

文章基本思路：

A 生物信息学分析：找到8个显著的lncRNA；

B 临床结果与生物信息学结果的结合：确定了1个Candidate lncRNA；

C 分子实验：证实了GClnc1的生物学机制；

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GClnc1 (BC041951) 与胃癌的关系

为了研究lncRNA与胃癌的关系，作者首先使用LncRNA芯片对10对胃癌/癌旁组织样本进行检测，发现了8个lncRNA在胃癌样本中显著升高。对分析的结果的可靠性进行验证，作者使用Real-time PCR在新的样本集中对这8个候选lncRNA的表达水平进行了检测（165对胃癌/癌旁），其中4个lncRNA得到验证。最后，作者用Kaplan–Meier 生存分析的方法，只发现GClnc1这个lncRNA的高表达与胃癌患者的不良预后显著相关。

在对正常胃组织、胃黏膜肠上皮化生组织、胃不典型增生组织和胃癌组织的研究中发现，GClnc1表达量逐渐升高；并且，其高表达和血管入侵、肿瘤大小等生理指标都是显著正相关的。这些结果表明，GClnc1高表达可能在胃癌初期就发挥了重要的作用，并且伴随胃癌共同发展，促进了癌症的恶化。

对之前的结果在新的胃癌样本中进行验证(103对胃癌/癌旁)，原位杂交的结果表明在胃癌组织中GClnc1的表达明显高于正常组织。

所以，GClnc1作为一个风险lncRNA，不仅增加了人们的患胃癌的风险，增加了胃癌的病情，降低了患者的预后，但是，它的机制到底是什么样子的呢？

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GClnc1的序列分析

首先要确定GClnc1是否是一个新发现的lncRNA，使用RACE PCR技术得到GClnc1的完整序列；其次，利用ChIP等技术确定了GClnc1的5’端RNA聚合酶II的结合位点和转录起始位点等序列的基本特征；结合生物信息学分析的方法对序列特点进行分析，发现该序列不具备编码蛋白质的能力。因此，GClnc1是一个新发现的lncRNA。

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GClnc1如何促癌

Ok，根据上面的分析已经从很多方面证明了GClnc1的促癌左右，但是作者并不满足于此，继续深入挖掘GClnc1到底是如何促癌的。首先，通过对比knockdown GClnc1表达的胃癌细胞与未作处理的胃癌细胞进行差异分析，2,050基因显著下调，1,894基因上调显著（看来GClnc1的功能很强大！）。对差异基因进行通路分析，这些基因主要富集在细胞增殖，转移，胃癌的化学药物抗性和胃癌的信号等通路上。

做完Pathway分析后，作者竟然还凶残的想要用实验来证明他的分析结果，观察是否有由于这4个通路变化导致表型的改变。耸人听闻的是，他还做到了。首先，在两个胃癌细胞系中做RNA沉默，GClnc1低表达的胃癌细胞的细胞增殖、入侵能力明显降低；其次，在小鼠试验中，肿瘤增长与大小和GClnc1表达正相关；然后，药物处理使GClnc1失敏，结果与之前的生信结果保持一致；最后，在细胞入侵和细胞转移的实验中，GClnc1低表达的胃癌细胞入侵和转移的能力都受到了抑制。这些结果都说明了GClnc1这个家伙在促癌方面有举足轻重的作用。

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GClnc1与WDR5/KAT2A复合体结合调节基因表达

上面一大波的实验，小编已经佩服的五体投地了。但是，你以到此为止了么？只能说我们too young to simple，作者的想法就是走自己的路，让我们无路可走。。。

有很多lncRNA会与转录因子、组蛋白调节因子等细胞因子相互作用，调节靶基因的表达，从而影响表型的变化。为此，作者又用一系列科学严谨（眼花缭乱）的实验，成功从195个候选的转录因子中找到了WDR5和KAT2A。甚至，他们还证明了是GClnc1的5’端与WDR5和KAT2A在胃癌细胞中特异性结合。

找到了互做的目标因子，下一步就要证明当GClnc1结合WDR5/KAT2A复合体后，如何和基因组结合调控靶基因的表达。根据ChIP-seq技术的结果发现，GClnc1被沉默后，147个基因被WDR5/KAT2A复合体共同结合调控表达。当GClnc1沉默时，80%候选基因的启动子区域与WDR5/KAT2A复合体结合下降。综上所述，GClnc1被knockdown后，调节了WDR5/KAT2A复合体与靶基因的结合效率。表达数据也再次证明了实验结果，在BGC823细胞系中沉默掉GClnc1，大部分WDR5/KAT2A复合体参与调控的基因表达也显著下降。说明GClnc1可能作为一个Scaffold与WDR5/KAT2A复合体相互作用，因此而具备了调控组蛋白修饰、基因表达等生命活动中。

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GClnc1调节SOD2的机制

根据上文中的分析结果，作者找到了很多可能被GClnc1调控的基因，所以，作者就从中挑选了一个基因，来进一步展示GClnc1的潜在生物机理。SOD2作为一个WDR5/KAT2A复合体的靶基因，不仅与GClnc1的表达显著正相关，在之前的文章中也证明SOD2与胃癌的恶化显著相关 [1, 2]。作者的研究步骤如下：第一，由于SOD2 和GClnc1基因序列有一定的重叠区域，所以作者首先确定的就是它们不是同一个转录本；第二，Real-time PCR和Western blot的结果都表明，GClnc1高表达会上调SOD2的表达，反之亦然；第三，萤光素酶实验则表明knockdown了GClnc1会影响SOD2启动子的转录水平；第四，反过来knockdown或者用CRISPR/Cas9技术knock out掉SOD2，胃癌细胞的增殖、入侵等表型也显著下降。在之后的实验中，作者证明了GClnc1有可能作为一个脚手架结构的lncRNA与WDR5/KAT2A复合体共同结合在SOD2的启动子区，反式激活该基因的转录。

感谢大家浪费自己宝贵的时间看小编写的推文，但是，小编发自肺腑的推荐这篇文章，不论是分析组或是实验组的小伙伴们，这篇文章都可以帮助大家学到很多东西。如果有时间，还是希望大家可以自己去仔细研读哦。

参考文献：

1. Janssen, A.M., et al., Superoxide dismutases in gastric and esophageal cancer and the prognostic impact in gastric cancer. Clin Cancer Res, 2000. 6(8): p. 3183-92.

2. Chen, P.M., et al., Activation of NF-kappaB by SOD2 promotes the aggressiveness of lung adenocarcinoma by modulating NKX2-1-mediated IKKbeta expression. Carcinogenesis, 2013. 34(11): p. 2655-63.

3. Sun, T.T., et al., LncRNA GClnc1 Promotes Gastric Carcinogenesis and May Act as a Modular Scaffold of WDR5 and KAT2A Complexes to Specify the Histone Modification Pattern. Cancer Discov, 2016. 6(7): p. 784-801.

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